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“DNA快速连接试剂盒”参数说明
| 种类： | 分子生物学工具酶 | 用途4： | 粘性末端连接 |
| 用途1： | 克隆 | 用途3： | 平末端连接 |
| 用途2： | 载体构建 |
“DNA快速连接试剂盒”详细介绍
概述：
DNA快速连接试剂盒显著缩短了DNA连接反应的时间。在室温 (25°C) 条件下，使用DNA快速连接试剂盒，5分钟即可完成DNA片段粘性末端或平滑末端的连接反应。
应用：
1. 载体构建。
2. 文库构建。
3. TA克隆。
4. Linker的连接。
5. 线形DNA的再环化。
质量检测：
本产品已按下述步骤检测转化效率：
pET28a载体经EcoRV消化 (平滑末端) 或HindIII消化 (粘性末端) 后，CIP处理，回收纯化。
pBR322 DNA经HaeIII消化产生的平滑末端插入片段和λDNA经HindIII消化产生的粘性末端插入片段，采用快速连接步骤，分别以3 : 1 (插入片段 : 载体) 的比例与同样酶切的pET28a载体相连接。连接产物的转化方法 (详见下文)。
每批产品检验均达到下面的标准：
转化效率 (转化子/μg)
载体再环化 插入片段的连接
粘性末端 >5×106 >1×106
平滑末端 >2×106 >1×106
未切割载体 2×107
质保声明：
DNA快速连接试剂盒经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。
快速连接步骤:
1. 混合50 ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用蒸馏水调整总体积为10 μl。
2. 加入10 μl 2× 快速连接酶反应缓冲液，混匀。
3. 加入1 μl快速T4 DNA连接酶，彻底混匀。
4. 室温 (25°C) 作用5分钟。
5. 冰上冷却，然后转化或贮存于-20°C。
6. 不要热失活，热失活会急速剧降低转化效率。
转化步骤：
快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化，推荐转化方法如下：
1. 冰上融化感受态细胞。
2. 在1.5 ml微量离心管中，冷却约5 ng (2 μl) 的连接混合物。
3. 在DNA样品中加入50 μl感受态细胞，通过反复吹吸温和混匀样品。
4. 冰上放置30分钟。
5. 42°C热休克30秒*，冰上冷却2分钟。
6. 加入950 μl室温培养基*，37°C温育1小时。
7. 取100 μl样品铺在适宜的固体培养基上。
8. 37°C培养过夜。
[*]：热休克的时间和温度以及复苏的过程请遵循感受态细胞说明书。
DNA快速连接试剂盒显著缩短了DNA连接反应的时间。在室温 (25°C) 条件下，使用DNA快速连接试剂盒，5分钟即可完成DNA片段粘性末端或平滑末端的连接反应。
应用：
1. 载体构建。
2. 文库构建。
3. TA克隆。
4. Linker的连接。
5. 线形DNA的再环化。
质量检测：
本产品已按下述步骤检测转化效率：
pET28a载体经EcoRV消化 (平滑末端) 或HindIII消化 (粘性末端) 后，CIP处理，回收纯化。
pBR322 DNA经HaeIII消化产生的平滑末端插入片段和λDNA经HindIII消化产生的粘性末端插入片段，采用快速连接步骤，分别以3 : 1 (插入片段 : 载体) 的比例与同样酶切的pET28a载体相连接。连接产物的转化方法 (详见下文)。
每批产品检验均达到下面的标准：
转化效率 (转化子/μg)
载体再环化 插入片段的连接
粘性末端 >5×106 >1×106
平滑末端 >2×106 >1×106
未切割载体 2×107
质保声明：
DNA快速连接试剂盒经过严格的质控检测，确保该产品具有最高的活性和纯度。
快速连接步骤:
1. 混合50 ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用蒸馏水调整总体积为10 μl。
2. 加入10 μl 2× 快速连接酶反应缓冲液，混匀。
3. 加入1 μl快速T4 DNA连接酶，彻底混匀。
4. 室温 (25°C) 作用5分钟。
5. 冰上冷却，然后转化或贮存于-20°C。
6. 不要热失活，热失活会急速剧降低转化效率。
转化步骤：
快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化，推荐转化方法如下：
1. 冰上融化感受态细胞。
2. 在1.5 ml微量离心管中，冷却约5 ng (2 μl) 的连接混合物。
3. 在DNA样品中加入50 μl感受态细胞，通过反复吹吸温和混匀样品。
4. 冰上放置30分钟。
5. 42°C热休克30秒*，冰上冷却2分钟。
6. 加入950 μl室温培养基*，37°C温育1小时。
7. 取100 μl样品铺在适宜的固体培养基上。
8. 37°C培养过夜。
[*]：热休克的时间和温度以及复苏的过程请遵循感受态细胞说明书。